Las técnicas de hibridación in situ (ISH) permiten detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) sobre preparaciones celulares y cortes de tejido. Estas técnicas han ido en incremento en los últimos años complementando a las técnicas de citogenética convencional. Se basan en la utilización de una sonda, un pequeño fragmento de ADN complementario a la región del genoma que se desea estudiar, que ha de ser detectable de manera visual mediante el marcaje de ésta. En función del tipo de molécula empelada para el marcaje de la sonda existen diferentes tipos de técnicas ISH.

Marcaje indirecto

Las sondas empleadas están marcadas con una molécula que por si sola no puede detectarse de manera visual requiriéndose de una reacción secundaria para la detección de ésta, de igual manera que ocurre con las técnicas inmunohistoquímicas. Existen dos tipos de técnicas ISH con marcaje indirecto:

Hibridación in situ cromogénica (CISH): En este tipo de técnicas, la sonda se encuentra conjugada a biotina-avidina o digoxigenina. Tras una reacción enzimática, el producto obtenido es detectable visualmente mediante la utilización de un microscopio óptico en campo claro.
Hibridación in situ con plata (SISH): En este tipo de técnicas, la sonda se encuentra conjugada con dinitrofenol. Tras una reacción con sales de plata, el producto final es detectable a través de un microscopio óptico en campo claro.

Marcaje directo

Las sondas empleadas están directamente marcadas con un fluorocromo. Tras la excitación de éste a la longitud de onda adecuada, emitirá una señal de fluorescencia permitiendo la detección directa de ésta mediante la utilización de un microscopio de fluorescencia. La técnica que emplea este tipo de marcaje es la hibridación in situ fluorescente (FISH).

Así pues, basándose en la capacidad que tienen los ácidos nucleicos para unirse entre sí por complementariedad de bases (A-T, C-G), estas técnicas se convierten en una herramienta eficaz para la detección de alteraciones cromosómicas y genéticas.

Al contrario que muchas otras técnicas citogenéticas empleadas para el estudio de cromosomas, las técnicas ISH presentan la ventaja de que no requieren trabajar con células en división, pudiéndose realizar en células en metafase o interfase.

Bases de la metodología FISH

Para llevar a cabo la técnica FISH se ha de realizar en primer lugar la desnaturalización del ADN y la sonda empleada a temperaturas elevadas (70-80 °C) de manera que se produzca la separación de las dos cadenas de nucleótidos, posibilitando así la unión de las mismas por complementariedad. Posteriormente se procede a la hibridación del ADN de la muestra objeto de estudio y la sonda mediante incubación a 37°C. Finalmente, la preparación obtenida se visualiza en campo oscuro con microscopio de fluorescencia.

Existen una gran variedad de fluorocromos que pueden utilizarse para el marcado de las sondas, emitiendo así señales de fluorescencia diferentes. La utilización de sondas marcadas con diferentes fluorocromos permite la hibridación de múltiples sondas sobre una única muestra aportando valor añadido a la técnica de FISH (multi-FISH).

Tipos de sondas FISH

Dentro de las sondas utilizadas en FISH, podemos encontrar sondas centroméricas, sondas de locus especifico y sondas de pintado cromosómico.

Sondas centroméricas: Hibridan en las regiones repetitivas del ADN localizadas en el centrómero del cromosoma (regiones α o β-satélites). El empleo de este tipo de sondas permite el análisis de alteraciones en el número de cromosomas, aneuploidías.
Sondas locus específico: Hibridan en una región de ADN concreta del genoma, dicha región puede comprender la secuencia de un gen o una región mayor, banda cromosómica. Este tipo de sondas se emplean para detectar la perdida o ganancia de material genético y alteraciones estructurales como traslocaciones e inserciones/fusiones.
Sondas de pintado cromosómico: Se trata de una batería de sondas que en conjunto hibridan con un cromosoma completo específicamente.

Estas sondas se pueden utilizar de manera única o conjunta dependiendo del diseño del estudio. A continuación, se muestran algunos ejemplos de patrones de señales de las sondas FISH en estudios realizados de manera convencional.

Estudios de variación del número de copias:

Señal verde: Sonda control (centromérica o locus específico).

Señal roja: Sonda localizada en la región de estudio.

Estudios de reordenamientos génicos (traslocaciones y fusiones):

Sondas Break-apart (traslocación): Estudio del intercambio/desplazamiento de material genómico entre dos cromosomas.

Sondas de Fusión: Estudio de la unión de dos regiones génicas, producida bien por una traslocación previa o por una deleción, que hace que dos genes que en principio se encuentran distantes en el genoma entren en proximidad.

Bibliografía:

Imágenes obtenidas de la página web: https://www.cytocell.com/
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